A、有无膜性细胞器不是根本区别，A错误；B、有无成型的细胞核是结构上的区别，不是根本区别，B错误；C、染色体有无不同不是根本区别，C错误；D、大肠杆菌与酵母菌最根本的区别是遗传物质的不同，也就是DNA不同，D正确．故选：D．
