亚硝酸钠合分光光度法测定总黄酮的原理为:在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下,黄酮类化合物与钠盐生成螯和物,加入氢氧化钠溶液后显红橙色,在500波长处有吸收峰且符合定量分析的比尔定律,一般与芦丁标准系列比较定量.如果细说,亚硝酸钠显色法是先用亚硝酸钠还原黄酮, 再加亚硝酸钠络合,最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环,生成 2’羟基查耳酮而显色.它的显色原理发生在黄酮醇类成分邻位无取代的邻二酚羟基部位,不具有邻位无取代邻二酚羟基的黄酮醇类成分加入上述试剂时是不显色的.
加亚硝酸钠还原被氧化的酚羟基,使其能与铝离子络合,并且提供一个碱性环境(在酸性环境中铝离子不与邻二酚羟基络合),络合之后,产生一个稳定的特征吸收峰,但是在这个波长之下,杂质干扰较多,因此加氢氧化钠使吸收峰红移,避免杂质干扰(杂质不红移)。