量的问题,楼上的已经回答了。
讲一下抗体的用法:
一般1毫升样本加10微升抗体,室温避光孵育半小时,PBS洗涤3次,最后重新悬浮于500微升PBS。还有就是,在加入你要的抗体前,要加入无荧光的非特异性抗体,先孵育15分钟,以封闭细胞表面的Ig受体,这个不需要洗涤。
你除了购买CD34, CD4, CD8三种不同荧光标记的抗体外,还需要另外购买和这三种抗体荧光颜色相同的同型非特异性抗体,比如你的CD抗体都是IgG1,那你就要3种颜色的非特异性IgG1。
上机的时候,除了样本以外,需要如下额外的7个管子来调机器:
1. 不加任何抗体的,用来调节FCS和SCC
2. 3个管子,分别加了同型非特异抗体,经过了孵育和洗涤。分别用来设置3种荧光通道的阴性Gate
3. 3个管子,分别单独加了特异性CD3, CD4 和CD8 荧光抗体的,分别用来设置3种荧光的阳性Gate,并设置机器的compensation
4. 最后才是你加了3个抗体,经过孵育和洗涤的样本
一般细胞数量为每份10E6,最少也最好不要低于5*10E5。做流式,最好用直标,购买的时候一定要看好别弄错了