免疫PCR的制作方法

1 试剂
包被缓冲液：20mmol/L Tris-HCI(pH9.5），含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3;
洗涤液：20mmol/L Tris-HCI(pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20;
稀释液：20mmol/L Tris-HCI(pH7.5），含150mmol/L NaCl0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA (0.1mg/ml)
2 操作
1）包被
用包被缓冲液稀释抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃过夜（约15h），用洗涤液洗板3次×5min。
2）封闭：
每孔加200μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl(pH7.5）（含150mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80min，洗板数次。
3）抗原抗体反应：
用释释液1:8000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50μl，室温（～22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未结合的抗体分子。
4）链亲合一蛋白A结合反应：
每孔加入50μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温（～22℃）50min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10min，再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。
5）PCR
实验条件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明胶（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每种0.2mM）、2μM引物（每一引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。
PCR周期 PCR前，用紫外线（UV）（254nm）照射上述反应混合物，然后将之加入到微滴板孔中，每孔40μl，再加20μlUV照射的石蜡覆盖，按下述温度在PCR仪上进行PCR周期：起始变性94℃5min;30个周期：变性94℃5min，退火58℃1min，延伸72℃1min，最后延伸72℃ 5min，得到的PCR产物为特定的261bp的片段。 ⒈ 用0.85% NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度。
⒉ 加50μl于微孔板内，4℃过夜。同时设阴性对照（加50μl 0.85% NaCl于另一孔内）。
⒊ 用400μl的0.05% 温20pBS（以下简称TPBS），洗涤五次。
⒋ 加入2.25%的100μl正常山羊血清（NGS) PBS封闭2小时.
⒌ 用含0.15% NGS的TPBS洗3次.
⒍ 加入100μl用0.75% NGS适当稀释的单克隆抗体（内含100μg的鲜鱼精DNA），室温孵育30min.
⒎ 用TPBS洗涤五次.
⒏ 加入50μl适量稀释的生物素化抗鼠IgG抗体，室温孵育30min.
⒐ 用TPBS洗涤五次.
⒑加入60μl适量稀释的生物素化DNA和亲和素，室温孵育30min.
⒒用TPBS洗涤五次，再用HPLC级水洗三次.
⒓PCR扩增：加入50μl PCR反应液（内含T3和T7引物），95℃ 60sec,50℃ 110sec,72℃ 110sec，循环30次.取PCR产物10μl于1.7%琼脂糖凝胶上电泳，和核酸分子量标准相比较，在相应的位置邮现电泳带为阳性.必需时将电泳结果照相，进行定量分析. 1）凝胶检测系统 用凝胶扫描仪或计算机辅助视频设备对溴化乙锭染色的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行定量，放射性标记的扩增产物可通过放射自显影定量测定，最近用自动DNA测序仪检测荧光标记的核酸，这种方法可准确测量扩增产物的大小，而且其检测灵敏度达fg水平，但由于自动DNA序列仪和荧光标记引物极为昂贵，所以现在仅用于研究。
2）HPLC检测系统 此法的优点为PCR产物不用纯化，对未标记的产物灵敏度可达fg水平，对标记产物的检测限度可能更低。HPLC能区分不同分子的大小，可允许我们使用不同大小的内标衡量扩增的效率。
3） 固相测定系统 最常用的为96孔聚苯乙烯微量滴定板，可用仪器比色或读数，可用亲合素分子通过疏水相互作用包被滴定板，此固相系统可特异结合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR产物的定量，如用生物素和地高辛双重标记的扩增产物可用微量滴定板法定量，将生物素和地高辛同时标记PCR产物的方法有三种途径：①在反应混合物中同时加入地高辛和生物素标记的脱氧核苷酸类似物（DIG-/Bio-dUTP）；②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP；③加入生物素引物1和地高辛标记的引物2。定量方方法为：双重标记的扩增产物用乙醇沉淀以去除未结合的标记物，然后加至亲合素包被的微量滴定板上温育至少2小时，洗涤数次后，与DIG抗体：AP结合物温育，根据其底物不同可产生不同的颜色，亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术是一个有效、灵活和容易操作的技术，将成为定量PCR的一个关键技术。
4）SPA(Scintillation Proximity Assay）系统 用亲合素包被的氟微球作为固相载体，用生物素标记引物，在扩增时掺入氟化的核苷酸，扩增完成后，加入已包被的氟微球以捕获生物素化的PCR产物，此捕获过程可使与氟微球紧密结合，氟被氘激发产生光脉冲，可用闪烁计数仪测量。与比色法相比，此法具有更大的线性范围。
5）点杂交检测系统 将扩增产物变性后固定于尼龙膜表面，与标记的DNA探针杂交，亦可将序列特异的寡核苷酸探针通过多聚T(poly T）尾巴固定于膜上，与变性后的已标记的扩增产物杂交，在后者由于靶基因不是直接结合于膜表面，故其反应动力学接近于液相，反应速度快，通常使用生物素化的探针或扩增产物，用亲合素-AP结合物产生颜色斑点，通过与已知浓度的标准比较颜色强度进行定量。
6） 电化学发光检测系统 通过亲合素-生物素系统将扩增产物结合于磁性珠，然后与2，2'-联吡啶-钌螯合物（TBR）标记的探针杂交，加入三丙胺（tripropylamine，TPA）溶液，并转移至电化学发光仪的检测池，当电极的电压增加至一定水平时TPA和TBR都瞬时氧化，TPA氧化后生成一种不稳定的、具有高度还原性的中间物质，可与氧化的TBR反应，使之进入激发态，当由激发态变为基态时可发射出620nm的光，发光强度与TBR标记物的量成正比，通过发光强度对PCR产物定量，此法的敏感性为amol水平，可自动化测量。
7） DNA酶免疫测定系统 通过抗DNA单克隆抗体与扩增产物结合、再通过酶第二抗体结合物进行定量测定。此法不需对引物和扩增产物进行标记，但易出现交叉反应和单克隆抗体昂贵的费用限制了此法的广泛应用。
8） 激光诱导荧光检测法 首先用荧光标记物FAM（商品名）的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物借助氨已基连接臂偶联于正向引物的5'-核苷酸上，然后PCR扩增，用毛细管电泳扩增产物，最后用氩离子激光光原检测器检测荧光强度进行定量测定。此法的优点为样本用量少，可自动化检测，快速、灵敏和高分辨率。
总之，可用上述方法对靶基因定量，其准确性可通过复管测定和利用内标使数据标准化而得到提高。由于亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术具有有效、灵活和容易操作等特点，有较好的临床应用前景。定量PCR仍然存在技术上的问题，目前多用于研究，但在肿瘤、细菌、真菌和病毒性疾病的诊断和治疗方面对此技术的需求将日益增加。